Интерферон гамма гепатит в

Интерферон гамма гепатит в

Association of Interferon-gamma Induced Protein 10 Promoter Polymorphisms with the Disease Progression of Hepatitis B Virus Infection in Chinese Han Population
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3762918/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: DX SX. Выполняли эксперименты: ZX YL LL. Проанализированы данные: XL. Добавленные реагенты / материалы / инструменты анализа: YR HW YM. Написал документ: SB.

Предполагается, что индуцированный интерфероном гамма-протеин 10 (IP-10) участвует в поражении печени при вирусном гепатите. Это исследование предназначалось для исследования влияния одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) G-201A (rs1439490) в гене IP-10 на прогрессирование заболевания вируса гепатита B (HBV).

-201 SNP в промоторе IP-10 был генотипирован у 577 пациентов с различными категориями заболеваний и 275 контролем за состоянием здоровья; Активность промотора IP-10 in vitro сравнивали между гаплотипом GG и гомозиготами АА с использованием репортерной системы люциферазы в клетках HepG2. Экспрессия IP-10 in vivo сравнивалась между пациентами с генотипом -201 АА и генотипом GG.

Обнаруженная частота SNP G-201A составила 17,8%, 25,3%, 26,6% и 13,8% для пациентов с острым гепатитом В (AHB), пациентов с легким хроническим гепатитом В (CHB-M), пациентов с тяжелым хроническим гепатитом B ( CHB-S) и контроля здоровья соответственно. Активность люциферазы, индуцированная промотором на основе IP-10 in vitro в трансфецированных pGL3-Enhancer-201A клетках HepG2, была в 1,43 раза выше, чем в трансфецированных pGL3-Enhancer-201G клетках HepG2 (P

G-201A в промоторной области гена IP-10 ассоциировался с прогрессированием заболевания печени у пациентов с ВГВ-инфекцией путем повышения уровня экспрессии IP-10.

Вирус гепатита B (HBV) сам по себе является нецитопатическим, а повреждение печени, вызванное инфекцией HBV, в основном иммунизировано [1]. Клиническое разрешение и прогрессирование заболевания HBV-инфекции являются следствием взаимодействия между иммунными ответами хозяина и вирусными факторами. Сообщалось, что генетические восприимчивости, такие как некоторые одиночные нуклеотидные полиморфизмы (SNP) в генах человека, связаны с вирусным разминированием при HBV-инфекции [2], [3], [4]. Тем не менее, до сих пор неясно, какие человеческие SNP вовлечены и как они влияют на развитие заболевания, связанного с HBV [5].

Интерферон-гамма (IFN-γ) участвовала как в врожденном, так и адаптированном иммунном ответе, а IFN-γ индуцирует протеин 10 (IP-10), представляет собой цитокин, который химически привлекает Т-клетки и NK-клетки, которые экспрессируют лиганды CXCR3 [6], [ 7]. Секретирование моноцитами, эндотелиальными клетками, дендритными клетками и т. Д., IP-10 широко участвует в самонаведении иммунных клеток, апоптозе, росте клеток и ангиостатических эффектах [8]. В частности, уровень ИБ-10 в сыворотке был повышен у пациентов с вирусным гепатитом и повышен у гепатита С, чем при гепатите В. Экспрессия IP-10 коррелировала с гистологической серьезностью и долевым воспалением у пациентов с хронической инфекцией вируса гепатита С [9]. Уровень плазменного IP-10 в дооперационном периоде (обрезание: 600 пг / мл) может спрогнозировать, сможет ли стандартная помощь (интерферон плюс телопревир) для гепатита С достичь быстрого вирусного ответа или устойчивого вирусного ответа [10]; средний уровень IP-10 в сыворотке у пациентов со спонтанным клиренсом HCV был ниже, чем у пациентов без спонтанного зазора [11]. Экспрессия полиморфизма IP-10 и IL28B в сыворотке в настоящее время является наилучшей предсказательной комбинацией маркеров для спонтанного клиренса HCV [12]. При инфицировании HBV экспрессия IP-10 наблюдалась значительно ниже, чем исходный уровень у вирусологических ответчиков, в то время как не наблюдалась у пациентов, не ответивших [13]. Уровень IP-10 в сыворотке также был значительно связан с тяжести воспаления печени, особенно у пациентов с только вирусом дикого типа в другом исследовании. Ограниченные исследования проводились с воздействием IP-10 на инфекцию HBV в отличие от инфекции HCV.

Механизм, влияющий на аффинность связывания IP-10 с CXCR3, до конца не до конца понят. В предыдущем исследовании 21 SNP были распознаны путем анализа последовательности гена IP-10 длиной 4228 bp, и ни один из них не был в кодирующей области [14]. Среди выявленных SNP G-201A в области промотора располагался между ядерным фактором κβ1 и сайтами связывания ядерного фактора κβ2 и поэтому был выбран для исследования [14], [15]. Гипотеза нашего исследования заключается в том, что изменения в области промотора могут влиять на иммунный ответ, изменяя экспрессию IP-10 и дополнительно влияя на прогрессирование болезни. Поэтому мы исследовали частоты аллелей G-201A в группе острого гепатита B (AHB), умеренного хронического гепатита B (CHB-M) и тяжелого хронического гепатита B (CHB-S), а также дальнейший функциональный анализ этого SNP в vitro и in vivo.

Исследовательская популяция состояла из 577 не связанных китайских пациентов с HBV, которые посетили Пекинскую больницу 302 и 275 здоровых людей, которые пожертвовали в центре донора крови в больнице Пекина 302. Пациенты были отнесены к подгруппам AHB (196), CHB-M (193) и CHB-S (188) с увеличением степени тяжести заболевания. Классификация была основана на диагностических критериях Схемы управления вирусным гепатитом в 2000 году, опубликованной Китайским обществом инфекционных заболеваний и паразитологии, и Китайским обществом гепатологии Китайской медицинской ассоциации [16]. Вкратце, критериями для AHB были: нет историй инфекции HBV; острое возникновение симптомов; и спонтанный клиренс HBsAg в течение 6 месяцев после первоначального начала болезни. Критерии для CHB-M были: истории инфекции HBV; сохранение HBsAg в течение как минимум 6 месяцев; гистопатологический диагноз легкой травмы печени с совместимыми лабораториями или ультрасонографией. Критерии для CHB-S: симптомы тяжелой травмы печени; значительное повышение сывороточной аланинаминотрансферазы (ALT). Подтверждение диагноза CHB-S проводилось при соблюдении одного из следующих условий: (1) уровень альбумина в сыворотке> 32 г / л; (2) общий билирубин сыворотки (TBIL)> 85,5 мкмоль / л; (3) активность протромбина в плазме (PTA)

HC, здоровый контроль; AHB, острый гепатит B; CHB-M, умеренный хронический гепатит B; CHB-S, тяжелый хронический гепатит B.

Исследовательский интерес представляли полиморфизмы SNPs G-201A в 5′-фланкирующей области гена IP-10. Поскольку полиморфизмы G-201A и C-1596T были в абсолютном LD (D ‘= 1, r2 = 1, в образце проверки 387) в предыдущем исследовании [14], генотипы G-201A были выведены из генотипов C-1596T , тогда как определение для последнего осуществляется с помощью экономически эффективного метода — анализ полиморфизма длины фрагментарной фрагментарной ДНК (PCR-RFLP) внутриклеточной полимеразной цепной реакции. А именно, геномную ДНК экстрагировали из 140 мкл сыворотки с использованием набора ДНКутов (Tiandz Engineering, Пекин, Китай); экстрагированную ДНК растворяли в 80 мкл буфера Трис-HCl (0,1 моль / л, рН 8,0) и хранили при -40 ° С перед использованием. Праймерами для ПЦР с первым раундом были F (5’-CATCCTAGGATCAGGCTACTGT-3 ‘) и R (5′-AGCTGACAACTTAGATACCAAC -3′); праймерами для ПЦР второго раунда были F (5’-GCAGATACTGTCTCAGAACCTGGTA-3 ‘) и R (5′-TGTCACCATCTCTCATTTTGATTGT-3’). ПЦР первого круга состояла из денатурации при 94 ° С в течение 3 мин и 30 циклов при 94 ° С в течение 25 с, 52 ° С в течение 25 с, 72 ° С в течение 50 с. ПЦР второго раунда состояла из денатурации при 94 ° С в течение 3 мин и 30 циклов при 94 ° С в течение 20 с, 54 ° С в течение 20 с, 72 ° С в течение 40 с. Ампликон длиной 499 пар были продуктами ПЦР, которые очищали с помощью набора для очистки PCIA QIAquick (Qiagen, США). После очистки 5 мкл продуктов ПЦР расщепляли в пределах 15 U Xba I (Takara BioTech, Далянь, Китай) для генотипирования полиморфизмов C-1596T. Расщепленные фрагменты ДНК идентифицировали ультрафиолетовым светом после электрофореза в 2% агарозном геле, окрашенном бромидом этидия. Гомозиготы с аллелями C-1596T давали рестрикционные фрагменты 174/325 пар оснований.

Точность информации о генотипировании для каждого аллелей -201A, которая была отнесена к анализу ПЦР-RFLP, была подтверждена путем случайного отбора 45% образцов из изученной популяции. Полиморфизмы G-201A амплифицировали методом ПЦР. Праймерами для ПЦР первого круга были F (5′-TCAAGGAGGACTGTCCAGGTAAATC-3 ‘) и R (5′-TGGCAGTTTGATTCATGGTGC-3′), ПЦР второго раунда были F (5’-GGAGGACTGTCCAGGTAAATCACTG-3 ‘) и R ( 5’-TGAGGAATGTCTCAGAAAACGTGG-3 ‘). Условия для амплификации G-201A ПЦР первого и второго раундов были такими же, как и для усиления C-1596T. Секвенирование проводили с использованием анализаторов ДНК ABI 3730xl (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Для репортерной плазмиды были выбраны геномные ДНК из гаплотипов GG и AA-гомозигот полиморфизма G-201A. Были амплифицированы фрагменты ДНК, соответствующие зоне промотора IP-10 от нуклеотидов от -875 до +27 (относительно первого нуклеотида открытой рамки считывания IP-10). Праймерами для ПЦР первого круга были F (5′-GAACCCCATCGTAAATCAACCTG-3 ‘) и R (5′-CCTTGAATGCCACTTAGAGTCAG-3′); для ПЦР второго круга были F (5’-CGGGGT ACCCAAGGTCTGTCTCTATGCGTGC-3 ‘) (введенный Kpn I как подчеркнутый) и R (5′-CCCAAG CTTGCAGCAAATCAGAATGGCAGTTTG-3’) (введен Hind III). Условия для ПЦР первого и второго раундов были такими же, как описано выше. Продукты ПЦР очищали с помощью набора QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) после очистки, продукты инкубировали с ДНК-полимеразой dATP и Taq для добавления A и очищали с помощью набора для экстракции гель QIAquick. Лигирование и трансформация выполнялись в соответствии с инструкциями производителя pGEM-T Vector System II (Promega Madison, WI, USA). Плазмиды экстрагировали и расщепляли Kpn I и Hind III, а фрагменты ДНК-промотора IP-10 очищали с помощью набора для экстракции гель QIAquick. Фрагмент лигировали с вектором pGL3-Enhancer и затем трансфецированными трансфецированными клетками HepG2 (Promega Madison, WI, USA). Все репортерные конструкции и трансформации подтверждались прямым секвенированием после переваривания с Kpn I и Hind III.

Клетки HepG2 (3 × 105) разделяли на 6-луночные планшеты перед трансфекцией. Каждая лунка трансфицировали 2 мкг одной из конструкций вместе с 0,2 мкг pRL-TK-вектора (Promega), который служил в качестве внутреннего контроля эффективности трансфекции с помощью трансфекционного реагента FuGENE HD (Roche, США). Через 48 часов клетки собирали и активность люциферазы измеряли с использованием системы анализа с двумя люциферазными репортерами (Promega). Мера проводилась в трех экземплярах.

Цельная кровь была получена у 24 пациентов, включая пятнадцать пациентов с генотипом АА и девять пациентов с генотипом -201 ГГ. Клеточная РНК экстрагировалась из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) с использованием набора RNeasy Mini (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Уровни мРНК IP-10 определяли с помощью PCR SYRR Green в реальном времени (Roche) с бета-актином в качестве внутреннего контроля. Праймерами для IP-10 были 5′-GCAGTTACACTAAAAGGTGACC -3 ‘и 5′-GGAAGCAGGGTCAGAACATC-3’, праймеры для бета-актина были 5-GAGATGCGTTGTTACAGGAAG-3 и 5-CACGAAAGCAATGCTATCACC-3. Эксперименты были предварительно сформированы в двух экземплярах.

Статистический анализ проводился в SPSS (версия 16.0; SPSS Inc, Чикаго, Иллинойс). Анализ хи-квадрат использовался для расчета разницы частот генотипов G-201A среди групп. Тест Cochran-Armitage использовался для изучения линейного тренда. Тест tent был использован для анализа репортерных анализов люциферазы и транскрипционной экспрессии IP-10 в генотипе G-201A и G-201G in vitro и in vivo. Значения P менее 0,05 считались статистически значимыми.

Процентное содержание -201А, содержащего генотип в -201, составляло 17,8%, 25,3%, 26,6% и 13,8% для пациентов с АГБ, CHB-M, CHB-S и здоровых контролей соответственно. Общее значение Р среди четырех групп составляло 0,0037 по общему критерию хи-квадрат. Тест линейного тренда Cochran-Armitage (P = 0,0029, Z = -2,97) показал тенденцию к частоте G-201A среди групп (таблица 2). Сопряженное сравнение показало значительные различия в частоте SNP между HC и CHB-M, HC по сравнению с CHB-S, AHB и CHB-S, а также отношение шансов и значение P (таблица 3). Для тестовой последовательности метода детектирования SNP метод ПЦР-RFLP показал идентичность 98,7% с результатами прямого секвенирования ПЦР методом Kappa и показал, что эти два метода были статистически достоверными (P

HC, здоровый контроль; AHB, острый гепатит B; CHB-M, умеренный хронический гепатит B; CHB-S, тяжелый хронический гепатит B.

обозначает P

HC, здоровый контроль; AHB, острый гепатит B; CHB-M, умеренный хронический гепатит B; CHB-S, тяжелый хронический гепатит B.

Геномные области от нуклеотидов -875 до +27 промотора IP-10 клонировали в векторы pGL3-Enhancer для измерения активности люциферазы. Вставленные последовательности всех репортерных конструкций были идентичны, за исключением нуклеотидов на сайте -201. Конструкции pGL3-Enhancer-201A показали в 1,43 раза более высокую относительную активность люциферазы, чем конструкции pGL3-Enhancer-201G (P

(а) активность люциферазы в клетках HepG2, трансфицированных векторами-промотором-репортерами, соответствующими гомозиготам -201GG или AA-гаплотипов соответственно. Вертикальная ось представляет собой относительную долю активности люциферазы к соответствующим векторам pGL3-энхансера. Данные представляют собой среднее число репрезентативных данных из трех экспериментов, выполненных в четырех экземплярах. Значения Р оценивали по критерию Стьюдента t. (b) Экспрессия CXCL10, измеренная с помощью количественной SYRR PCR РНК, очищенной от мононуклеарных клеток периферической крови 24 пациентов. Столбцы означают трехмерные измерения; бары, SD.

Выражение IP-10 на уровне транскрипции в РВМС измеряли с помощью ПЦР в реальном времени и сравнивали между пятнадцатью -201 пациентами АА и девятью -201 ГГ пациентами в два независимых периода выборки. Соотношение транскрипта IP-10 и β-актина в РВМС у -201 пациентов с АА было в 1,38 раза выше, чем у -201 ГГ пациентов (Р

Многие методы практически доступны для обнаружения SNP, и в настоящем исследовании был адаптирован метод ПЦР-RFLP для легкого определения SNP сывороточных образцов. По сравнению с методом прямого секвенирования метод ПЦР-RFLP является быстрым, экономически эффективным, менее требовательным к лабораторному анализу, что благоприятно для изучения большой популяции. Анализ был подтвержден прямым секвенированием для 45% образцов, и два теста показали идентичность 98,7% со статистической консистенцией.

Один SNP может вызывать заболевание, такое как болезнь Менделя, в то время как один SNP часто функционирует в координации с другими SNP, чтобы проявлять заболевание, наблюдаемое при остеопорозе и болезни Хиршпрунга [17], [18]. Большое внимание было уделено влиянию генетической восприимчивости в развитии CHB. Предыдущие исследования подтвердили, что SNP на rs3077 и rs9277535 в области HLA-DP были подвержены хроническому гепатиту В [19], тогда как три SNP риска HCC в KIF1B не были связаны с прогрессированием к CHB [20]. В этом исследовании мы исследовали генетическую восприимчивость G-201A в IP-10 для гепатита B и предложили возможный механизм путем проведения функционального сравнения in vitro и in vivo.

Повышение IP-10 влияет на иммунные реакции хозяина на инфекцию, изменяя активность клеток, которые экспрессируют рецепторы CXCR3 [21], [22], [23]. Например, перекрестные помехи между T-регуляторными клетками (Tregs) и клетками естественного киллера T (NKT) опосредовались IP-10: при активации клетки NKT выделяют большие количества IFN-γ, что индуцирует продукцию IP-10 и IP-10 chemoattract Tregs (которые экспрессируют рецепторы CXCR3). В здоровом организме Tregs подавляют активацию эффекторной Т-клетки для поддержания иммунного гомостаза [24]. Однако в CHB Tregs локализуют иммунный ответ и способствуют сохранению HBV-инфекции в нашем предыдущем наблюдении [25]. Таким образом, более высокий уровень IP-10 означает более вербовку Tregs, особенно в печени, и предлагает более сильное ингибирование иммунных реакций. В частности, Tregs, полученные из печени, экспрессируют более высокий уровень CXCR3 по сравнению с полученными из крови Tregs [26], что делает ингибирование еще более сильным.

Множество факторов может способствовать повышению уровня IP-10. Наблюдалось снижение экспрессии рецептора CXCR3 на плазмоцитоидных дендритных клетках, сопровождающееся повышенным уровнем IP-10 в плазме у пациентов с хроническим HBV [27], предполагая, что дисфункция или понижающая регуляция рецептора CXCR3 может привести к повышению регуляции IP -10. В этом исследовании мы проиллюстрировали SNP в промоторе IP-10, который мог бы регулировать экспрессию IP-10 путем изменения его сродства к связыванию и, следовательно, влиять на прогрессирование заболевания. Частота аллелей А была самой низкой в ​​здоровом контроле и была самой высокой у пациентов с CHB-S. Линейная тенденция увеличения частоты G-201A у пациентов с AHB, до CHB-M и CHB-S подразумевала предрасполагающую роль этого SNP. Функциональный анализ подтвердил, что аллельные вариации G-201A усиливают активность промотора IP-10 in vitro и регулируют транскрипционную экспрессию IP-10 in vivo. Эти результаты показали, что SNP на -201 играл роль в том, как люди реагируют на вирус и развивают постоянную инфекцию.

Однако мы не исследовали потенциальные SNP за пределами гена IP-10, которые сотрудничают с G-201A, и мы не исследовали другие идентифицированные SNP в гене IP-10 из-за того, что наиболее часто встречающийся SNP C-1513T был одинаково представлен между HBV без прогрессирования и прогрессирующие носители в проницательном исследовании [14].

Таким образом, в настоящем исследовании объясняется вклад G-201A в область промотора гена IP-10 в прогрессирование заболевания CHB. Возможные механизмы G-201A, влияющие на прогрессирование заболевания, изменяли иммунные ответы посредством повышения уровня экспрессии IP-10.



Источник: rupubmed.com


Добавить комментарий